۱۳۹۹-۰۴-۲۹، ۰۱:۵۷ ب.ظ
(آخرین ویرایش در این ارسال: ۱۳۹۹-۰۴-۲۹، ۰۱:۵۹ ب.ظ، توسط yektatajhiz.)
متد اصلی کار : استخراج DNA به روش ستونی
موارد کاربرد: از این روش برای استخراج DNA ژنومی از نمونه خون محیطی استفاده می شود.
اساس روش آزمایش استخراج DNA ژنومی:
این تکنولوژی ابتدا با لیز سلولی و سپس با حذف پروتئینها با استفاده از chatropic salt و پروتئیناز K و اتصال DNA به بستر سیلیکانی، سپس شست شوی DNA با اتانول عمل می کند. در نهایت اندازه DNA تخلیص شده تا 50kb ( 20-30kb) می باشد.
از جمله مزایای این روش نسبت به استخراج به روش اشباع نمک، زمان سریعتر انجام این تست است.
DNA ژنومی را می توان از خون کامل (تازه یا فریز شده)، پلاسما، سرم، بافی کوت، مایعات بدن، لنفوسیت و سلولهای کشت داده شده استخراج کرد.
نمونه مورد نیاز در بخش نمونه گیری: 5-10ml خون محیطی
نوع نمونه مورد نیاز دربخش فنی: نمونه خون محيطي
مقدار محصول: 100-300 میکرولیتر بافی کوت که به نوع نمونه و تعداد سلولهای موجود در نمونه بستگی دارد.
ظرف : لوله های فالکن 15ml یکبار مصرف دارای ضد انعقاد K2-EDTA
معیارهای غیرقابل قبول بودن نمونه:
نمونه لخته باشد
در ضد انعقادی بجز EDTA جمع آوری شده باشد.
حجم کمتر از 5 ml
نگهداری نمونه:
نمونه خون محیطی پیش از استخراج در صورت نگهداری در دمای اتاق 24 ساعت، تا 2 هفته در دمای 40c قابل نگهداری می باشد.
نمونه DNA ژنومی پس از پروسه استخراج DNA ،در باکس های مخصوص میکروتیوب 1.5ml، تا 1 سال در دمای 40 c و تا چندین سال در دمای 0 c20- قابل نگهداری می باشد.
وسایل و تجهيزات مورد نیاز جهت انجام آزمایش استخراج DNA :
میکروفیوژ يخچال دار
سانتریفيوژ يخچال دار
نانودراپ
سمپلر متغیر
سر سمپلر
میکروتیوب 5 ml
بن ماری یا هیتر بلاک
ورتکس
دستکش یک بار مصرف
لوله های فالکون 15 میلی لیتری
باكس مخصوص نگهداري ميكروتيوب 5 ml
مواد مصرفی مورد نیاز در انجام آزمایش استخراج DNA ژنومی به روش ستونی:
محتویات کیت Favorprep Blood Genomic DNA extraction minikit باید در دمای اتاق15-250 c) نگهداری شوند.
RNase A (انتخابی)
آب مقطر استریل
اتانول ℅96
فرایند انجام آزمايش
محتویات کیت شامل:
BG Buffer (آماده مصرف)
Wash1 Buffer (قبل از استفاده برای اولین بار، به این بافر 8 میلی لیتر اتانول 96-100% اضافه می کنیم)
Wash 2 Buffer(قبل از استفاده برای اولین بار، به این بافر 40 میلی لیتر اتانول 96-100% اضافه می کنیم)
Elution Buffer (بهتر است بافر را قبل از مصرف الیکوت کنیم )
پروتئیناز کا mg 11 که مقدار 1.1ml به آن sterile ddH2O1 اضافه می کنیم
BG Mini Column
Collection tube
Elution Tube
ابتدا در دفتر استخراج، كاراكترها، كد، تاريخ استخراج، روش استخراج و نام فرد استخراج كننده را ثبت می کنیم.
به تعداد نمونه ها، میکروتیوب 5 ml برداشته و بر روي جدار و درب لوله ها كد و كاراكتر نمونه را مي نويسيم.
نمونه مورد استفاده خون کامل و یا بافی کوت است .
* تهیه بافی کوت: . برای تهیه بافی کوت خون کامل را با دور 3000 rpmبمدت 7 دقیقه یا 800g به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ می کنیم. مایع سفید رنگ تشکیل شده بین لایه گلبولهای قرمز در پایین و پلاسما در بالا، بافی کوت می باشد. برای جدا کردن لایه بافی کوت بهتر است سرم روی بافی کوت را به آهستگی با پیپت خارج کرده و یا سمپلر 1000 بافی کوت را خارج کنیم. DNA استخراج شده از بافی کوت مقدار 10-5 برابر DNA نسبت به خون کامل خواهد داشت.
. 300 µl از بافی کوت به میکروتیوب 5 ml منتقل می کنیم.
نکته: اگر حجم نمونه کمتر از200 µl باشد، با استفاده (PBS (HORC-UB-W-22-00 یا سرم فیزیولوژی، به حجم 200 µl می رسانیم.
وقتی بافی کوت برمیداریم نیاز به شستشو با آب مقطر نیست ولی وقتی با مقداری خون برداشته میشود حتما شستشو با آب مقطر انجام میگردد یکبار یا دو بار بستگی به مقدارRBC.(شستشو میتواند در میکروتیوپ و با دور 8000 rpm و به مدت 5 دقیقه انجام شود)
. در صورتی که نمونه DNA Genomic RNase free مورد نیاز است µl 4 از RNase A اضافه کرده و 2 دقیقه در دمای اتاق انکوبه می کنیم بعد مرحله بعد را انجام می دهیم .در غیر این صورت مرحله شماره 3 را بلافاصه انجام می دهیم.
20 µ پروتئیناز K (که در یخچال باید نگهداری شود) وµl 200 از بافر BG به نمونه ها اضافه کرده ، سپس کامل ورتکس کنید.(نکته : قبل از اضافه کردن BG حتما نمونه ها ورتکس شود) سپس به مدت 60-30 دقیقه در دمای60 درجه سانتی گراد انکوبه می کنیم تا سلولها لیز شوند .در طی انکوباسیون نمونه ها را هر 10 دقیقه یکبار ورتکس می کنیم.(در صورت غلیظ بودن نمونه را میتوان به دو میکروتیوپ منتقل کرد و ادامه مراحل را انجام داد)
.نمونه ها را اسپین کنید سپس µl 200 اتانول 100-96 % اضافه کرده و به مدت 3 ثانیه کاملا ورتکس کنید.(ورتکس در این مرحله خیلی اهمیت دارد)
.نمونه ها را اسپین کنید . برای هر نمونه یک BG Column را روی یک Collection tube قرار می دهیم و نمونه را روی ستون می بریم و با دور 8000 rpm به مدت2 دقیقه سانتریفیوژ کنید.(به هیچ عنوان اگر لخته ای وجود داشت به ستون منتقل نمی کنیم)
.ستونها را روی Collection tubes جدید قرار داده و وµl 500 W1buffer به ستونها اضافه کرده و با دور 14000 rpm به مدت2دقیقه سانتریفیوژ کنید. .)(در صورت شفاف نبودن نمونه میتوان این مرحله را تکرار کرد ولی مدت 1 دقیقه )
. .ستونها را روی Collection tubes جدید قرار داده و وµl 750 Wash buffer به ستونها اضافه کرده و با دور 14000 rpm به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ کنید.در صورت شفاف نبودن نمونه میتوان این مرحله را تکرار کرد ولی به مدت 1 دقیقه
. برای خشک شدن ستونها ، با دور 14000 rpm به مدت 3 دقیقه سانتریفیوژ کنید.
. ستونها را روی میکروتیوب جدید قرار داده وµl 200-100 از الوشن بافر یا ddH2O (PH : 7.5-9.0)
وسط ستونها ریخته شود و پس از 30- 60 دقیقه با دور 14000 rpm به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ شود.
نکته : حجم استاندارد الوشن بافرµl 200 می باشد ولی در صورت کم بودن سلول می توان جهت افزایش غلظت DNA، مقدار الوشن بافر را از µl 150-50 کاهش داد.
. نمونه های DNA را در 4 درجه سانتیگراد یا 20– درجه سانتیگراد نگهداری کنید.
منبع: یکتا تجهیز آزما
موارد کاربرد: از این روش برای استخراج DNA ژنومی از نمونه خون محیطی استفاده می شود.
اساس روش آزمایش استخراج DNA ژنومی:
این تکنولوژی ابتدا با لیز سلولی و سپس با حذف پروتئینها با استفاده از chatropic salt و پروتئیناز K و اتصال DNA به بستر سیلیکانی، سپس شست شوی DNA با اتانول عمل می کند. در نهایت اندازه DNA تخلیص شده تا 50kb ( 20-30kb) می باشد.
از جمله مزایای این روش نسبت به استخراج به روش اشباع نمک، زمان سریعتر انجام این تست است.
DNA ژنومی را می توان از خون کامل (تازه یا فریز شده)، پلاسما، سرم، بافی کوت، مایعات بدن، لنفوسیت و سلولهای کشت داده شده استخراج کرد.
نمونه مورد نیاز در بخش نمونه گیری: 5-10ml خون محیطی
نوع نمونه مورد نیاز دربخش فنی: نمونه خون محيطي
مقدار محصول: 100-300 میکرولیتر بافی کوت که به نوع نمونه و تعداد سلولهای موجود در نمونه بستگی دارد.
ظرف : لوله های فالکن 15ml یکبار مصرف دارای ضد انعقاد K2-EDTA
معیارهای غیرقابل قبول بودن نمونه:
نمونه لخته باشد
در ضد انعقادی بجز EDTA جمع آوری شده باشد.
حجم کمتر از 5 ml
نگهداری نمونه:
نمونه خون محیطی پیش از استخراج در صورت نگهداری در دمای اتاق 24 ساعت، تا 2 هفته در دمای 40c قابل نگهداری می باشد.
نمونه DNA ژنومی پس از پروسه استخراج DNA ،در باکس های مخصوص میکروتیوب 1.5ml، تا 1 سال در دمای 40 c و تا چندین سال در دمای 0 c20- قابل نگهداری می باشد.
وسایل و تجهيزات مورد نیاز جهت انجام آزمایش استخراج DNA :
میکروفیوژ يخچال دار
سانتریفيوژ يخچال دار
نانودراپ
سمپلر متغیر
سر سمپلر
میکروتیوب 5 ml
بن ماری یا هیتر بلاک
ورتکس
دستکش یک بار مصرف
لوله های فالکون 15 میلی لیتری
باكس مخصوص نگهداري ميكروتيوب 5 ml
مواد مصرفی مورد نیاز در انجام آزمایش استخراج DNA ژنومی به روش ستونی:
محتویات کیت Favorprep Blood Genomic DNA extraction minikit باید در دمای اتاق15-250 c) نگهداری شوند.
RNase A (انتخابی)
آب مقطر استریل
اتانول ℅96
فرایند انجام آزمايش
محتویات کیت شامل:
BG Buffer (آماده مصرف)
Wash1 Buffer (قبل از استفاده برای اولین بار، به این بافر 8 میلی لیتر اتانول 96-100% اضافه می کنیم)
Wash 2 Buffer(قبل از استفاده برای اولین بار، به این بافر 40 میلی لیتر اتانول 96-100% اضافه می کنیم)
Elution Buffer (بهتر است بافر را قبل از مصرف الیکوت کنیم )
پروتئیناز کا mg 11 که مقدار 1.1ml به آن sterile ddH2O1 اضافه می کنیم
BG Mini Column
Collection tube
Elution Tube
ابتدا در دفتر استخراج، كاراكترها، كد، تاريخ استخراج، روش استخراج و نام فرد استخراج كننده را ثبت می کنیم.
به تعداد نمونه ها، میکروتیوب 5 ml برداشته و بر روي جدار و درب لوله ها كد و كاراكتر نمونه را مي نويسيم.
نمونه مورد استفاده خون کامل و یا بافی کوت است .
* تهیه بافی کوت: . برای تهیه بافی کوت خون کامل را با دور 3000 rpmبمدت 7 دقیقه یا 800g به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ می کنیم. مایع سفید رنگ تشکیل شده بین لایه گلبولهای قرمز در پایین و پلاسما در بالا، بافی کوت می باشد. برای جدا کردن لایه بافی کوت بهتر است سرم روی بافی کوت را به آهستگی با پیپت خارج کرده و یا سمپلر 1000 بافی کوت را خارج کنیم. DNA استخراج شده از بافی کوت مقدار 10-5 برابر DNA نسبت به خون کامل خواهد داشت.
. 300 µl از بافی کوت به میکروتیوب 5 ml منتقل می کنیم.
نکته: اگر حجم نمونه کمتر از200 µl باشد، با استفاده (PBS (HORC-UB-W-22-00 یا سرم فیزیولوژی، به حجم 200 µl می رسانیم.
وقتی بافی کوت برمیداریم نیاز به شستشو با آب مقطر نیست ولی وقتی با مقداری خون برداشته میشود حتما شستشو با آب مقطر انجام میگردد یکبار یا دو بار بستگی به مقدارRBC.(شستشو میتواند در میکروتیوپ و با دور 8000 rpm و به مدت 5 دقیقه انجام شود)
. در صورتی که نمونه DNA Genomic RNase free مورد نیاز است µl 4 از RNase A اضافه کرده و 2 دقیقه در دمای اتاق انکوبه می کنیم بعد مرحله بعد را انجام می دهیم .در غیر این صورت مرحله شماره 3 را بلافاصه انجام می دهیم.
20 µ پروتئیناز K (که در یخچال باید نگهداری شود) وµl 200 از بافر BG به نمونه ها اضافه کرده ، سپس کامل ورتکس کنید.(نکته : قبل از اضافه کردن BG حتما نمونه ها ورتکس شود) سپس به مدت 60-30 دقیقه در دمای60 درجه سانتی گراد انکوبه می کنیم تا سلولها لیز شوند .در طی انکوباسیون نمونه ها را هر 10 دقیقه یکبار ورتکس می کنیم.(در صورت غلیظ بودن نمونه را میتوان به دو میکروتیوپ منتقل کرد و ادامه مراحل را انجام داد)
.نمونه ها را اسپین کنید سپس µl 200 اتانول 100-96 % اضافه کرده و به مدت 3 ثانیه کاملا ورتکس کنید.(ورتکس در این مرحله خیلی اهمیت دارد)
.نمونه ها را اسپین کنید . برای هر نمونه یک BG Column را روی یک Collection tube قرار می دهیم و نمونه را روی ستون می بریم و با دور 8000 rpm به مدت2 دقیقه سانتریفیوژ کنید.(به هیچ عنوان اگر لخته ای وجود داشت به ستون منتقل نمی کنیم)
.ستونها را روی Collection tubes جدید قرار داده و وµl 500 W1buffer به ستونها اضافه کرده و با دور 14000 rpm به مدت2دقیقه سانتریفیوژ کنید. .)(در صورت شفاف نبودن نمونه میتوان این مرحله را تکرار کرد ولی مدت 1 دقیقه )
. .ستونها را روی Collection tubes جدید قرار داده و وµl 750 Wash buffer به ستونها اضافه کرده و با دور 14000 rpm به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ کنید.در صورت شفاف نبودن نمونه میتوان این مرحله را تکرار کرد ولی به مدت 1 دقیقه
. برای خشک شدن ستونها ، با دور 14000 rpm به مدت 3 دقیقه سانتریفیوژ کنید.
. ستونها را روی میکروتیوب جدید قرار داده وµl 200-100 از الوشن بافر یا ddH2O (PH : 7.5-9.0)
وسط ستونها ریخته شود و پس از 30- 60 دقیقه با دور 14000 rpm به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ شود.
نکته : حجم استاندارد الوشن بافرµl 200 می باشد ولی در صورت کم بودن سلول می توان جهت افزایش غلظت DNA، مقدار الوشن بافر را از µl 150-50 کاهش داد.
. نمونه های DNA را در 4 درجه سانتیگراد یا 20– درجه سانتیگراد نگهداری کنید.
منبع: یکتا تجهیز آزما
